… о старении и клеточных технологиях

Технология перепрограммирования взрослых клеток человека в стволовые названа журналом Nature одним из самых значимых прорывов в науке последнего десятилетия. Судя по феерической скорости научных достижений в этой области, такие клетки будут применяться для лечения и омоложения уже в ближайшем будущем.
Мы все получаемся из одной клетки, которая начинает делиться, образуя сначала некий невыразительный шарик, а затем все более похожую на маленькое человеческое тельце форму. На первых этапах деления все клетки одинаковы. Их называют эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), а еще — всемогущими, или плюрипотентными, потому что каждая из них может превратиться в клетку крови или кожи, кости или мозга, в любую из 220 видов клеток нашего организма. Всего от трех до пяти дней они находятся в таком всемогущем состоянии, потом начинается их путь дифференцировки в клетки конкретных тканей и органов. Внимание ученых давно привлекают уникальные возможности эмбриональных стволовых клеток, которые могут быть прекрасным материалом для лечения различных заболеваний, связанных с дефектами клеток. Исследователи уже немалого достигли в этой области, научившись выделять ЭСК, культивировать их, выращивать на их основе различные ткани или применять в отдельных клинических испытаниях. Такими заявлениями в последнее десятилетие ученые буквально засыпали СМИ. Однако использование эмбриональных стволовых клеток наталкивалось на массу трудностей как этического, так и технического характера, в связи с чем велся поиск возможностей получения стволовых клеток из взрослых организмов. Это тоже оказалось делом нелегким. Во-первых, во взрослом организме стволовые клетки уже не обладают тотальной универсальностью; во-вторых, добывать их нужно, как правило, травматичным путем.
В какой-то момент появилась шальная мысль, что клетку взрослого организма можно попытаться вернуть в ее всемогущее состояние. Почему бы нет? В каждой клетке имеется один и тот же геном, но включены разные программы: в эмбриональных стволовых работает один набор генов, в клетках крови — другой, в клетках кожи — третий и т. д. Если научиться манипулировать этими программами, то можно добиться конвертации одной клетки в другую. И ученым это удалось. Они всего в шаге от создания безопасной и эффективной технологии репрограммирования клеток.

Коктейль для мышиного хвоста
Попытки получить для терапии всемогущие клетки начались сразу после выделения Джеймсом Томсоном из Университета Висконсин в 1998 году эмбриональных стволовых клеток человека. В процессе исследований была выработана такая технология получения и хранения ЭСК, при которой клетки могли сохранять свои универсальные потенции весьма длительное время. В нужный срок их можно было бы дифференцировать в различные клетки тканей. Параллельно ученые пытались решить проблему совместимости клеток, ведь эмбриональные клетки — чужие, а найти такие донорские ЭСК, которые бы полностью подходили конкретному пациенту, весьма затруднительно. Поэтому родилась технология клонирования: ядро соматической, или взрослой, клетки переносится в яйцеклетку, после чего может появиться организм, идентичный тому, у кого было взято ядро соматической клетки. Так появилась знаменитая овечка Долли. Таким способом были клонированы мышки, рыбки и прочие зверюшки в единичных экземплярах, были даже скандальные сообщения о клонировании человека, но до сих пор официальных данных об успешном получении таким способом эмбриональных стволовых клеток человека нет. Поскольку исследования в области ЭСК ограничены, а в некоторых странах и по сей день не разрешены (нельзя использовать человеческие эмбрионы), ученые искали более этичные способы получения всемогущих клеток, похожих своими свойствами на ЭСК.
В ноябре 2006 года в журнале Cell появилось сенсационное сообщение исследователя из японского Университета Киото Шиньи Яманаки, где говорилось, что ему с коллегами удалось из взрослых клеток кожи получить клетки со свойствами эмбриональных стволовых, то есть репрограммировать взрослые клетки до юного состояния. Клетки назвали iPS cells — индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК).
Это достижение базировалось на огромной работе генетиков всего мира, проделанной в конце ХХ — начале XXI века. Благодаря проекту «Геном человека» стали известны все гены, работающие в человеческом организме. Было выяснено, в частности, какие гены работают, а не «молчат» в эмбриональных стволовых клетках. Среди них открыты гены так называемых транскрипционных факторов, которые ученые стали уважительно именовать генами-господами. Эти гены-господа не отвечают за рутинную деятельность клетки, они через кодируемые ими белки активируют другие гены, которые и поддерживают клеточное всемогущее состояние. Одновременно бурно развивались технологии манипулирования генами. Появилась возможность вырезать их из кусочков ДНК, вставлять в различные конструкции и заставлять работать, продуцируя те или иные белки.
Шинья Яманака выделил 24 гена, которые, на его взгляд, играют главную роль в эмбриональной стволовой клетке. Он взял фибробласт (предшественницу клетки кожи) мышиного хвоста и вставил в его ядро все 24 гена с помощью так называемой ретровирусной технологии, когда искусственный вирус с пришитыми к нему генами вводится в клетку и в ядре встраивается в ее геном. Эксперимент удался. Дальше уже пошла игра с перебиранием генов. Яманака сначала поделил 24 гена на две произвольные половинки и снова провел эксперименты с группами по 12 генов, затем делил еще пополам, сравнивал результаты — так он искал самые важные для поддержания состояния, близкого к ЭСК, и самые эффективные гены. В конце концов он остановился на четверке генов, которая позже была названа «магическим коктейлем Яманаки». В коктейль вошли гены Oct3/4 , Sox2, c-Myc, Klf4.
Следом за Яманакой об успехах в репрограммировании клеток объявил и Джеймс Томсон из Университета Висконсин-Мэдисон. Изначально он выделил 35 важных для ЭСК генов, а потом тоже остановился на четверке, где два были теми же генами, что использовал Яманака, Oct3/4 и Sox2, и еще два других — Nanog и Lin28. Томсону удалось с помощью своей четверки обратить сначала мышиный, а затем и человеческий фибробласт в ИПСК — индуцированную плюрипотентную клетку.
После этих сообщений во влиятельных научных журналах многие лаборатории включились в исследовательскую гонку. Работать было над чем. Во-первых, ученые признавали, что доставка нужных генов в клетку с помощью вирусных векторов может использоваться разве что в пробирке. Вводить же в организм такую конструкцию опасно: вирус встраивает ее прямо в геном, после чего в геноме могут начаться непредусмотренные перестройки. Во-вторых, в коктейле Яманаки присутствовал очень сильный протоонкоген c-Myc, способный активировать в организме возникновение опухолей.
«Многие гены, связанные с плюрипотентностью, связаны и с опухолеобразованием, — объясняет руководитель лаборатории клеточных технологий Института общей генетики им. Н. И. Вавилова профессор Сергей Киселев. — Мы анализировали и сравнивали эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные, взрослые клетки и раковые. У эмбриональных, индуцированных плюрипотентных и раковых много общего не только в генетической программе, но и в эпигенетической. Эпигенетические факторы оказывают влияние на работу генома в зависимости от внешних обстоятельств. И когда мы превращаем взрослую клетку в индуцированную плюрипотентную, у нее включаются те гены, которые должны работать в плюрипотентных клетках, и выключаются те гены, которые работали во взрослой соматической клетке. При этом у нее меняется и эпигенетический профиль — со взрослого на тот, который характерен для плюрипотентных клеток».

Заставить господ работать
Для того чтобы исключить риск развития опухолей и прочих геномных перестроек, тот же Яманака и другие ученые пытались еще более сузить набор нужных генов, избавившись в первую очередь от протоонкогена c-Myc. «Выяснилось, что в некоторых соматических клетках, к примеру, нейрональных, два из четырех генов “яманакского коктейля” и так работают довольно продуктивно, — комментирует Сергей Киселев. — И достаточно туда добавить только один ген, который, как выяснилось в целом ряде работ, является самым главным — Oct3/4, чтобы клетки начали превращаться в плюрипотентные».
Ученые думали над тем, как еще можно заставить работать этих «господ». Группа из исследовательского Института Скриппса в Калифорнии сначала попробовала репрограммировать взрослые клетки мыши уже не с помощью самих четырех генов, а с помощью белков, вырабатываемых этими генами. Это удалось. Чуть позже группа тех же биологов под руководством Шэна Дина заявила, что им удалось таким способом создать индуцированные плюрипотентные клетки уже из клеток кожи человека. Подобную же технологию повторили группы Роберта Ланцы из компании Stem cell & Regenerative Medicine и Квана Соо из Гарварда.
«Однако сама технология производства используемых для этой технологии рекомбинантных белков достаточно сложна и затратна, — рассказывает Сергей Киселев. — Поэтому возникла идея, а не попробовать ли запускать в клетку не белки, а их матричную РНК (напомним, что в организме для создания нужного белка сначала с гена ДНК считывается информация на матричную РНК, а затем по этой информации на РНК собирается белок. — “Эксперт”). РНК вводится в клетку, производит белки, которые и запускают процесс репрограммирования. Такую работу проделала наша группа в Институте общей генетики. Сначала мы тоже повторяли работы с вирусными векторами и генами Яманаки, а затем решили использовать синтезированные нами РНК с этих генов. И у нас получилось. Мы запатентовали этот метод в 2009 году. Позже результаты сходной работы были опубликованы группами из Израиля и США».
Но и на этом ученые не успокоились. Тот же Шэн Дин, использовавший белки важных генов, предложил принципиально новую технологию, которая, по его мнению, может не только сделать ИПСК безопасными, но и более дешевыми. В 2008 году он заявил, что смог заменить два из четырех генов низкомолекулярными химическими соединениями, а в конце прошлого года нашел способ заменить «химией» уже три гена. По словам Дина, эти химические вещества хорошо известны и никак не могут повредить работе генома, к тому же они не требуют таких затрат, как биологические компоненты. «Мы всего лишь в шаге от конечной цели, — заявил Дин. — Наша технология произведет революцию». Свой химический коктейль Шэн Дин уже называет Святым Граалем. Однако будет ли этот последний компонент найден, пока остается главной интригой, ведь непокоренным остался самый важный для всемогущих клеток ген — Oct3/4.

Дело за клиникой
Такое пристальное внимание к ИПСК понятно. Их можно использовать для лечения пока не излечиваемых или плохо излечиваемых заболеваний, многие из которых связаны с генетическими мутациями, а также для трансплантации нужных тканей и органов.
Первое подтверждение, что индуцированные плюрипотентные клетки используются для лечения генетических заболеваний у мышей, было получено в лаборатории профессора Whitehead Рудольфа Яниша. Модельные мыши с человеческой серповидноклеточной анемией — наследственным заболеванием, при котором нарушен белок гемоглобин, были вылечены с помощью генной терапии и индуцированных клеток. Сначала во взрослых клетках мышиной кожи «исправили» гены с поломкой. Потом клетки подвергли репрограммированию, чтобы вернуть к плюрипотентному состоянию, а затем вырастить из них нормальные клетки крови, которых в больном организме не хватает. Эти клетки трансплантируют в кровь больной мыши, и она начинает выздоравливать.
Похожее подтверждение работающей технологии продемонстрировали и ученые из Центра регенеративной медицины в Барселоне (Испания), но уже на культуре человеческих клеток. Ученые попробовали победить такое редкое генетическое заболевание, как анемия Фанкони, которое приводит к ранней смерти из-за целого ряда нарушений в работе организма, в том числе и опухолевых процессов. Болезнь может быть вызвана мутацией в одном из 13 генов, связанных с анемией Фанкони. Ученые работали с фибробластами больных: сначала корректировали «больной» геном, затем превращали эти исправленные фибробласты с помощью вирусных векторов с пришитыми генами в индуцированные плюрипотентные клетки, а после направляли их специализацию в сторону гемопоэтических клеток — предшественниц клеток крови. Исследователи успешно прошли все этапы доклинических испытаний. «Мы пока не вылечили человека, но вылечили его клетки, — заявил руководитель группы Хуан-Карлос Бельмонте. — Теоретически мы можем трансплантировать их пациенту и победить болезнь». Клинические испытания сдерживались тем фактом, что испанцы использовали вирусные технологии, чреватые риском развития опухолей. Но поскольку есть и другие методы репрограммирования клеток, то эти проблемы в принципе решаемы.
«На самом деле для репрограммирования можно использовать различные методы, — считает Сергей Киселев, — в зависимости от поставленных задач. В частности, мы в своей лаборатории используем как вирусные векторы, так и РНК. Вирусные векторы можно использовать для создания модельных систем, а методы с использованием РНК или низкомолекулярными соединениями, если такой коктейль все же будет создан, уже могут быть применены и в терапии». Модельные системы могут пригодиться для поиска лекарственных средств. К примеру, в лаборатории Сергея Киселева таким образом ищут подходы к лечению болезни Паркинсона и болезни Хантингтона. Для модельных систем нужны испорченные болезнью нейроны, но их же не станешь выковыривать из черепа пациента. Поэтому берут его фибробласты, из них делают индуцированные плюрипотентные клетки. В этих клетках генетические мутации не исправляются, поскольку ученые потом на этих клетках, превращенных в нейроны, проводят скрининг химических веществ. «Таким образом, мы можем подобрать лекарство не только для конкретной болезни, но и для конкретного пациента, — объясняет Киселев. — Кстати, терапевтическое применение индуцированных плюрипотентных клеток тоже, на мой взгляд, нуждается в индивидуальном подходе. Пока ученые не знают, как и когда нужно вводить индуцированные плюрипотентные клетки, к примеру, в мозг. Пока более понятно клиническое применение для болезней, связанных с клетками крови, ведь там они приживаются и работают благодаря циркуляции крови». Возможно, уже совсем скоро для лечения сложных наследственных заболеваний, связанных с кровью, начнут использовать индуцированные плюрипотентные клетки, которые будут «своими» для каждого пациента. К лечению же других заболеваний, по мнению Киселева, лежит еще долгий путь: необходимо создать технологии для безопасного и эффективного введения клеток в нужное место и в нужное время, чтобы они были приняты организмом и работали в правильном направлении. Однако судя по той скорости, с которой развивается область клеточных технологий, клиническое применение индуцированных плюрипотентных клеток для лечения многих заболеваний, трансплантации тканей и органов, а также омоложения организма маячит на горизонте.

Галина КОСТИНА. «Эксперт», 21 февраля 2011 года